Modúl Ilroinnt / Deisiú / Táilliú TIANSeq

Faoi láthair, tá teicneolaíocht seicheamh ard-tréchur bunaithe go príomha ar theicneolaíocht seicheamhú na chéad ghlúine eile. Toisc go bhfuil fad léitheoireachta theicneolaíocht seicheamh na chéad ghlúine eile teoranta, ní mór dúinn an t-ord faid iomlán a bhriseadh síos i leabharlanna blúirí beaga chun seicheamh a dhéanamh. De réir riachtanais turgnaimh éagsúla seicheamh, is gnách go roghnaíonn muid seicheamhú aonchríche nó seicheamhú dúbailte. Faoi láthair déantar blúirí DNA leabharlann seicheamhú na chéad ghlúine eile a dháileadh de ghnáth sa raon 200-800 bp.

a) Tá droch-cháilíocht i DNA agus tá coscairí ann. Úsáid samplaí DNA d’ardchaighdeán chun cosc ​​a chur ar ghníomhaíocht einsím.

b) Ní leor an méid sampla DNA agus an modh saor ó PCR á úsáid chun leabharlann DNA a thógáil. Nuair a sháraíonn ionchur an DNA ilroinnte 50 ng, is féidir sreabhadh oibre saor ó PCR a dhéanamh go roghnach le linn an phróisis tógála leabharlainne. Má tá uimhir chóip na leabharlainne ró-íseal le seicheamh go díreach, is féidir PCR an leabharlann DNA a mhéadú tar éis ligation an oiriúnaitheora.

c) Mar thoradh ar éilliú RNA tá cainníochtú tosaigh míchruinn DNA ann. Féadfaidh éilliú RNA a bheith ann i bpróiseas íonúcháin DNA géanóm, a bhféadfadh cainníochtú míchruinn DNA agus luchtú DNA neamhleor a bheith mar thoradh air le linn na leabharlainne a thógáil. Is féidir RNA a bhaint trí chóireáil le RNase.

A-1

a) Tá blúirí beaga (60 bp-120 bp) le feiceáil De ghnáth is blúirí oiriúnaitheacha nó dimers iad na blúirí beaga a fhoirmíonn oiriúnaitheoirí. Féadann íonú le coirníní maighnéadacha Agencourt AMPure XP na blúirí oiriúnaitheora seo a bhaint go héifeachtach agus cáilíocht seicheamh a chinntiú.

b) Tá blúirí móra le feiceáil sa leabharlann tar éis aimpliú PCR Méadóidh méid blúire DNA na leabharlainne 120 bp tar éis an t-adapter a ligint. Má mhéadaíonn an blúire DNA níos mó ná 120 bp tar éis ligation an oiriúnaitheora, d’fhéadfadh sé a bheith ina chúis le aimpliú blúire neamhghnácha ar aimpliú iomarcach PCR. Má dhéantar líon na dtimthriallta PCR a laghdú, féadfar an cás a chosc.

c) Méid neamhghnácha blúirí DNA leabharlainne tar éis ligint an oiriúnaitheora Is é 60 bp fad an oiriúnaitheora sa trealamh seo. Nuair a ligtear dhá cheann na blúire do na hoiriúnóirí, ní mhéadóidh an fad ach 120 bp. Nuair a úsáidtear cuibheoir seachas an ceann a sholáthraíonn an trealamh seo, téigh i dteagmháil leis an soláthróir chun faisnéis ábhartha a sholáthar, mar shampla fad an oiriúnaitheora. Cinntigh le do thoil go leanann sreabhadh oibre agus oibriú an turgnaimh na céimeanna a thuairiscítear sa lámhleabhar.

d) Méid neamhghnácha blúire DNA roimh ligint an oiriúnaitheora Is féidir gurb é an chúis atá leis an bhfadhb seo ná dálaí imoibrithe míchearta le linn ilroinnt DNA. Ba cheart amanna imoibrithe difriúla a úsáid le haghaidh ionchur DNA éagsúil. Má tá an t-ionchur DNA níos mó ná 10 ng, molaimid an t-am imoibrithe 12 nóiméad a roghnú mar an t-am tosaigh le haghaidh barrfheabhsú, agus tá méid na blúire a tháirgtear ag an am seo den chuid is mó sa raon 300-500 bp. Féadfaidh úsáideoirí fad na blúirí DNA a mhéadú nó a laghdú ar feadh 2-4 nóiméad de réir a gceanglas féin chun na blúirí DNA a bharrfheabhsú leis an méid riachtanach.

A-2

a) Ní dhéantar an t-am ilroinnte a bharrfheabhsú Má tá an DNA ilroinnte ró-bheag nó ró-mhór, féach le do thoil ar na Treoirlínte maidir le Roghnú Ama Ilroinnte a chuirtear ar fáil sa treoir chun an t-am imoibrithe a chinneadh, agus an pointe ama seo a úsáid mar rialú, cuir ar bun freisin a córas imoibrithe chun 3 nóiméad a fhadú nó a ghiorrú chun coigeartú níos cruinne a dhéanamh ar am ilroinnte.

A-3

Dáileadh méid neamhghnácha DNA tar éis cóireála ilroinnte

a) Modh leá mícheart imoibrí ilroinnte, nó ní dhéantar an t-imoibrí a mheascadh go hiomlán tar éis leá. Leáigh an t-imoibrí Measc Einsím Ilroinnte 5 × ar oighear. Nuair a bheidh sé leáite, déan an t-imoibrí a mheascadh go cothrom trí bhun an fheadáin a scoilteadh go réidh. Ná vortex an imoibrí!

b) Tá EDTA nó truailleáin eile sa sampla ionchuir DNA Tá ídiú ian salainn agus oibreáin chealaithe sa chéim íonú DNA an-tábhachtach chun go n-éireoidh leis an turgnamh. Má thuaslagadh DNA in 1 × TE, bain úsáid as an modh a chuirtear ar fáil sa treoir chun ilroinnt a dhéanamh. Mura bhfuil an tiúchan EDTA sa tuaslagán éiginnte, moltar an DNA a íonú agus a thuaslagadh in uisce dí-ianaithe le haghaidh imoibriú ina dhiaidh sin.

c) Cainníochtú tosaigh míchruinn DNA Tá dlúthbhaint ag méid an DNA ilroinnte le méid an ionchuir DNA. Roimh chóireáil ilroinnte, tá cainníochtú cruinn DNA ag baint úsáide as Qubit, Picogreen agus modhanna eile riachtanach chun an méid cruinn DNA sa chóras imoibriúcháin a chinneadh.

 d) Ní leanann ullmhúchán an chórais imoibrithe an treoir Ní mór an córas imoibrithe ilroinnte a ullmhú ar oighear go docht de réir na dtreoracha. Chun an éifeacht is fearr a chinntiú, ba chóir na comhpháirteanna imoibriúcháin go léir a chur ar leac oighir agus ba cheart an córas imoibrithe a ullmhú tar éis fuaraithe iomlán. Tar éis an t-ullmhúchán a bheith críochnaithe, flick nó pipet le do thoil chun meascadh go maith. Ná vortex!

1. Cuirfidh modh measctha míchuí (vortex, ascalaithe foréigneach, srl.) Dáileadh neamhghnácha ar blúirí leabharlainne (mar a thaispeántar san fhigiúr seo a leanas), agus ar an gcaoi sin beidh tionchar aige ar cháilíocht na leabharlainne. Dá bhrí sin, agus an tuaslagán imoibriúcháin Fragmentation Mix á ullmhú agat, déan pípéad go réidh suas agus síos chun meascadh, nó bain úsáid as an méara chun flick agus meascadh go cothrom. Bí cúramach gan meascadh le vortex.

2. Ní mór DNA ard-íonachta a úsáid le haghaidh leabharlainne a thógáil

■ Sláine mhaith DNA: Tá an banda leictreafóiréis níos mó ná 30 kb, gan eireaball

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Caithfidh méid ionchuir DNA a bheith cruinn Moltar modhanna Qubit agus PicoGreen a úsáid chun DNA a chainníochtú, seachas Nanodrop.

4. Ní mór ábhar EDTA i dtuaslagán DNA a chinneadh Tá tionchar mór ag EDTA ar an imoibriú ilroinnte. Má tá ábhar EDTA ard, is gá íonú DNA a dhéanamh roimh an tástáil ina dhiaidh sin.

5. Ní mór an tuaslagán imoibriúcháin ilroinnte a ullmhú ar oighear Tá an próiseas ilroinnte íogair do theocht agus am imoibrithe (go háirithe tar éis feabhsaitheoir a chur leis). D’fhonn cruinneas an ama imoibrithe a chinntiú, ullmhaigh an córas imoibrithe ar leac oighir le do thoil.

6. Caithfidh an t-am imoibrithe ilroinnte a bheith cruinn Beidh tionchar díreach ag am imoibrithe na céime ilroinnte ar mhéid na dtáirgí blúire, agus ar an gcaoi sin beidh tionchar aige ar dháileadh méide na blúirí DNA sa leabharlann.

1. Cén cineál sampla is infheidhme maidir leis an trealamh seo?

Is féidir an cineál samplach is infheidhme den trealamh seo a bheith RNA iomlán nó mRNA íonaithe le sláine RNA maith. Má úsáidtear RNA iomlán chun an leabharlann a thógáil, moltar an trealamh ídithe rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) a úsáid chun rRNA a bhaint ar dtús.

2. An féidir samplaí FFPE a úsáid chun leabharlann a thógáil leis an trealamh seo?

Déanfar an mRNA i samplaí FFPE a dhíghrádú go pointe áirithe, le sláine choibhneasta lag. Agus an trealamh seo á úsáid agat chun an leabharlann a thógáil, moltar an t-am ilroinnte a bharrfheabhsú (an t-am ilroinnte a ghiorrú nó gan ilroinnt a dhéanamh).

3. Ag baint úsáide as an gcéim roghnaithe méide a chuirtear ar fáil sa lámhleabhar táirge, cad a d’fhéadfadh a bheith ina chúis leis an deighleog a cuireadh isteach diall beag?

Déanfar roghnú méide i gcomhréir dhlúth leis an gcéim roghnaithe méide sa lámhleabhar táirge seo. Má tá diall ann, d’fhéadfadh an chúis a bheith leis nach bhfuil na coirníní maighnéadacha cothromaithe go teocht an tseomra nó nach bhfuil siad measctha go hiomlán, níl an pípéad cruinn nó fanann an leacht sa rinn. Moltar na leideanna le asaithe íseal a úsáid don turgnamh.

4. Cuibheoirí a roghnú i dtógáil leabharlainne

Níl imoibrí oiriúnaitheora sa trealamh tógála leabharlainne, agus moltar an trealamh seo a úsáid in éineacht le Cuibheoir Innéacs Aonair TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC na leabharlainne

Brath cainníochtúil na leabharlainne: Úsáidtear Qubit agus qPCR chun tiúchan mais agus tiúchan molar na leabharlainne a chinneadh faoi seach. Tá an oibríocht i gcomhréir go docht le lámhleabhar an táirge. De ghnáth comhlíonfaidh tiúchan na leabharlainne riachtanais seicheamhú GNA. Raon dáilte leabharlainne a bhrath: Ag úsáid Agilent 2100 Bioanalyzer chun raon dáilte na leabharlainne a bhrath.

6. Uimhir timthriall aimplithe a roghnú

De réir na dtreoracha, is é 6-12 líon na dtimthriallta PCR, agus ba cheart líon na dtimthriallta PCR a theastaíonn a roghnú de réir ionchur an tsampla. I leabharlanna ard-toraidh, is gnách go mbíonn ró-aimpliú ag céimeanna éagsúla, rud a léirítear le buaic beagán níos mó tar éis bhuaic an raon sprice i mbrath Aganant 2100 Bioanalyzer, nó tá an tiúchan braite de Qubit níos ísle ná tiúchan qPCR. Is gnáth-fheiniméan é aimpliú éadrom, nach ndéanann difear do sheicheamh leabharlainne agus d’anailís sonraí ina dhiaidh sin.

7. Tá spikes le feiceáil i bpróifíl braite Agilent 2100 Bioanalyzer

Tá an chuma ar spící i mbrath Agilent 2100 Bioanalyzer mar gheall ar ilroinnt míchothrom samplaí, áit a mbeidh níos mó blúirí i méid áirithe, agus beidh sé seo níos soiléire tar éis saibhriú PCR. Sa chás seo, moltar gan an roghnú méide a dhéanamh, ie an riocht ilroinnte a shocrú go 94 ° C ar feadh 15 nóiméad goir, áit a bhfuil dáileadh na blúirí beag agus tiubhaithe, agus inar féidir an aonchineálacht a fheabhsú.