FastKing RT Kit (Le gDNase)

Tá RNA A-1 díghrádaithe

—— RNA ardchaighdeáin a fheabhsú gan aon éilliú. Ba cheart go mbeadh an t-ábhar as a mbainfear RNA chomh úr agus is féidir chun díghrádú RNA a chosc. Déan anailís ar shláine RNA ar fhoirmiú dínádúraithe roimh imoibriú RT. Tar éis eastóscadh RNA, ba chóir é a stóráil i formamide 100%. Má úsáidtear inhibitor RNase, ba cheart go mbeadh an teocht téimh <45 ° C, agus ba chóir go mbeadh an pH níos lú ná 8.0, ar shlí eile scaoilfidh an t-inhibitor gach RNase faoi cheangal. Thairis sin, ba cheart inhibitor RNase a chur leis i réitigh ina bhfuil DTT 0.8 0.8 mM.

Tá coscóirí ar imoibrithe tras-athscríobh ar RNA A-2

—— I measc na gcoscóirí trascríobh droim ar ais tá SDS, EDTA, gliocról, pireafosfáit sóidiam, spermidine, formamide, salann guanidine, srl. Measc an RNA rialaithe leis an sampla, agus déan comparáid idir an toradh agus an t-imoibriú RNA rialaithe le seiceáil an bhfuil inhibitor ann. Nigh deascadh RNA le eatánól 70% (v / v) chun coscairí a bhaint.

A-3 Annealing neamhleor de primers a úsáidtear chun an chéad snáithe de cDNA a shintéisiú

—— Faigh amach go bhfuil an teocht annealaithe oiriúnach do na préimheanna a úsáidtear sa turgnamh. Maidir le heicseamairí randamacha, moltar an teocht a choinneáil ag 25 ° C ar feadh 10 nóiméad sula sroicheann sé an teocht imoibrithe. Maidir le primers géine-shonracha (GSP), bain triail as GSP eile, nó aistrigh go oligo (dT) nó hexamer randamach.

A-4 Méid beag RNA tosaigh

—— Laghdaigh an méid RNA. Maidir le samplaí RNA faoi bhun 50 ng, is féidir 0.1 μg go 0.5 μg aicéitil BSA a úsáid sa chéad shnáithe sintéis cDNA

A-5 Ní chuirtear an spriocshraith in iúl sna fíocháin a ndéantar anailís orthu.

——Cuir fíocháin eile.

Teipeann ar imoibriú PCR A-6

—— Maidir le RT-PCR dhá chéim, ní féidir leis an teimpléad cDNA sa chéim PCR a bheith níos mó ná 1/5 de thoirt an imoibrithe.

A-1 Annealing neamhshonrach ar primers agus teimpléid

—— Níor chóir go mbeadh 2-3 dG nó dC i ndeireadh 3 'primers. Úsáid primers Gene-shonracha sa chéad shintéis snáithe in ionad primers randamach nó oligo (dT). Bain úsáid as teocht annealaithe níos airde sa chéad chúpla timthriall, agus ansin teocht annealaithe níos ísle. Úsáid polaiméaráise DNA Taq te-tosaithe le haghaidh PCR chun sainiúlacht an imoibrithe a fheabhsú.

A-2 Droch-dhearadh primers géine-shonracha

—— Lean na prionsabail chéanna maidir le dearadh primer aimplithe.

RNA A-3 éillithe le DNA géanóm

——Treat RNA le DNase I. de ghrád PCR. Cuir imoibriú rialaithe ar bun gan tras-athscríobh chun éilliú DNA a bhrath.

A-4 Foirmiú dimer primer

—— Dearadh primers gan seichimh chomhlántacha ag an deireadh 3 '.

A-5 Ró-ard Mg²⁺ tiúchan

——Athrú Mg²⁺ tiúchan do gach teimpléad agus teaglaim primer

A-6 Éillithe le DNA eachtrach

—— Úsáid leideanna atá frithsheasmhach in aerasóil agus einsímí UDG.

A-1 Tá ábhar an chéad táirge snáithe ró-ard

—— Laghdaigh méid an chéad táirge snáithe sa ghnáthchéim imoibriúcháin PCR.

A-2 Méid primer ró-ard in imoibriú PCR

—— Laghdaigh ionchur primer.

A-3 An iomarca timthriallta

—— Coinníollacha imoibrithe PCR a íoslaghdú agus líon timthriall PCR a laghdú.

A-4 Teocht annealaithe ró-íseal

—— Teocht annealaithe a mhéadú chun tionscnamh agus síneadh neamhshonrach a chosc.

A-5 Aimpliú neamhshonrach ar blúirí oligonucleotide a ghineann díghrádú DNase ar DNA —— Tarraing RNA ardchaighdeáin chun éilliú DNA a chosc.

Tá RT-PCR chun RNA a thras-scríobh go cDNA, agus ansin an cDNA droim ar ais tras-scríofa a úsáid mar theimpléad d’imoibriú PCR chun an sprioc-blúire a mhéadú. Roghnaigh ceachtar primers randamach, Oligo dT agus primers géine-shonracha de réir dhálaí sonracha an turgnaimh. Is féidir na primers thuas go léir a úsáid le haghaidh mRNA cille eukaryotic gearr gan struchtúr hairpin.

Randamach primer: Oiriúnach do RNA fada le struchtúr hairpin, chomh maith le gach cineál RNA mar rRNA, mRNA, tRNA, srl. Úsáidtear iad go príomha le haghaidh imoibriú RT-PCR de theimpléad aonair.

Oligo dT: Oiriúnach do RNA le heireaball PolyA (níl eireabaill PolyA ag RNA prokaryotic, Oligo dT rRNA eukaryotic agus tRNA). Toisc go bhfuil Oligo dT ceangailte le heireaball PolyA, éilítear go mbeidh cáilíocht na samplaí RNA ard, agus laghdóidh fiú méid beag díghrádaithe méid na sintéise cDNA lánfhada.

Primer a bhaineann go sonrach le géine: Comhlántach le seicheamh an teimpléid, atá oiriúnach do chásanna ina bhfuil seicheamh na sprice ar eolas.

Tá dhá bhealach ann:

1. Modh tagartha inmheánach: Go teoiriciúil, is blúirí DNA de fhaid éagsúla iad cDNA, mar sin tá smearaidh mar thoradh ar leictreafóiréis. Má tá raidhse RNA íseal, ní thaispeánfar aon táirge i leictreafóiréis, ach ní chiallaíonn sé sin nach méadóidh PCR aon táirge. Go ginearálta, is féidir tagairt inmheánach a úsáid chun cDNA a bhrath. Má tá torthaí sa tagairt inmheánach, is féidir cáilíocht cDNA a ráthú go bunúsach (i gcúpla cás, má tá an blúire sprioc-ghéine ró-fhada, d’fhéadfadh go mbeadh eisceachtaí ann).

2. Má tá géine aitheanta aimplithe leis an teimpléad seo, is féidir í a fhíorú le préimheanna na géine seo. Ní gá go gciallódh aimpliú na tagartha inmheánaí nach bhfuil aon fhadhb ann le cDNA. Toisc go bhfuil raidhse ard tagartha inmheánach i cDNA, is furasta é a mhéadú. Má dhéantar cDNA a dhíghrádú go páirteach ar chúiseanna éagsúla, ó thaobh na dóchúlachta de, beidh tionchar mór ar thorthaí PCR de sprioc-ghéinte raidhse íseal. Cé go bhfuil an tagairt inmheánach fós flúirseach, is dócha nach ndéanfar difear don aimpliú.

Díghrádú páirteach ar RNA. Sláine agus íonú RNA a bhrath

D’fhéadfadh go mbeadh ábhar RNA na speiceas éagsúil difriúil, ach go ginearálta, ba cheart go mbeadh dhá bhanda soiléire 28S agus 18S sa leictreafóiréis glóthach san RNA iomlán eastósctha, agus ba chóir go mbeadh gile an iar-bhanda dhá oiread níos airde ná an dara ceann. Tugann an banda 5S le fios go bhfuil RNA díghrádaithe, agus go bhfuil a ghile comhréireach le méid an díghrádaithe. Ní chiallaíonn aimpliú rathúil na tagartha inmheánaí nach bhfuil aon fhadhb ann le RNA, toisc go bhfuil an tagairt inmheánach an-flúirseach, is féidir RNA a aimpliú chomh fada is nach bhfuil an díghrádú dian. An OD₂₆₀/ OD₂₈₀ba cheart go mbeadh an cóimheas idir RNA íon arna thomhas ag speictrophotiméadar idir 1.9 agus 2.1. Laghdóidh méid beag eisíontas próitéine i RNA an cóimheas. Chomh fada is nach bhfuil an luach ró-íseal, ní dhéanfar aon difear do RT. Is é sláine RNA an rud is tábhachtaí do RT.

Ní féidir le síneadh na géine tagartha inmheánaí ach a léiriú gur éirigh le RT, ach ní gá go mbaineann sé le cáilíocht an tsnáithe cDNA. Toisc go bhfuil na blúirí tagartha inmheánacha de ghnáth beag i méid agus ard i slonn, is fusa a bheith rathúil maidir le tras-athscríobh. Mar sin féin, athraíonn méid agus slonn na sprioc-ghéine ó ghéine go géine. Ní féidir cáilíocht an cDNA a mheas ach trí thagairt inmheánach go háirithe i gcás na sprioc-blúirí atá níos faide ná 2 kb.

Tá struchtúir thánaisteacha chasta ag roinnt samplaí, nó tá ábhar saibhir GC acu, nó tá siad luachmhar le raidhse íseal. Sna cásanna seo, ba cheart droim ar ais transcriptase iomchuí a roghnú de réir mhéid na blúire sprice agus an tsampla. Maidir le teimpléid RNA a bhfuil ábhar ard GC agus struchtúr casta tánaisteach acu, tá sé deacair an struchtúr tánaisteach a oscailt ag teocht íseal, nó le tras-athscríobh droim ar ais coitianta. Maidir leis na teimpléid seo, is féidir Quant Reverse Transcriptase a roghnú, mar is léir go bhfuil a fheidhmíocht tras-athscríobh níos fearr ná feidhmíocht tras-athscríobh droim ar ais sraith M-MLV, ar féidir léi teimpléid RNA éagsúla a athscríobh go héifeachtúil agus RNA a thras-scríobh isteach sa chéad snáithe cDNA a mhéid. Nuair a bhíonn trealamh ginearálta tras-athscríobh droim ar ais á úsáid agat, ní féidir leis an gcóras 20 μl ach 1 μg den RNA iomlán a athscríobh. Tabhair aird, le do thoil, ar uas-acmhainn RT an trealaimh. Má chuirtear barraíocht leis an teimpléad, beidh trascríobh droim ar ais i bhfabhar an RNA le raidhse ard. Dá bhrí sin, is fearr gan dul thar acmhainn uasta an chórais.

A-1 Faigh amach an bhfuil RNA díghrádaithe go mór agus má éiríonn le RT

Go ginearálta, is minic gurb é díghrádú tromchúiseach RNA is cúis leis an mainneachtain aimpliú tagartha inmheánach. Cúis eile a d’fhéadfadh a bheith leis ná cliseadh trascríobh droim ar ais. Ní féidir tagairt inmheánach a úsáid mar chaighdeán chun cáilíocht shnáithe aonair cDNA a mheas, ach is féidir é a úsáid mar chaighdeán chun a mheas an bhfuil athscríobh droim ar ais rathúil mura bhfuil aon fhadhb ann maidir le cáilíocht an RNA. Is é an rud is tábhachtaí sa phróiseas tras-athscríobh droim ar ais teocht tairiseach agus córas imoibriúcháin tairiseach a choinneáil d’fhonn éifeachtúlacht imoibrithe a fheabhsú.

A-2 Faigh amach an bhfuil na préimheanna chun géinte tagartha inmheánacha a mhéadú iontaofa agus an bhfuil aon fhadhbanna le himoibrithe a úsáidtear i PCR.

Le haghaidh cainníochtú coibhneasta, caithfear RNA a chainníochtú roimh thras-athscríobh, rud a éilítear freisin i go leor trealamh tras-athscríobh, mar shampla, ionchur an RNA a chainníochtú mar 1 μg. Ós rud é gur réiteach measctha é an cDNA droim ar ais tras-scríofa, lena n-áirítear RNA, oligo dT, einsím, dNTP, agus fiú beagán iarmhar DNA, beidh diall ann, mar sin tá sé dodhéanta an cDNA a chainníochtú go cruinn. Dá bhrí sin, tá gá le cainníochtú RNA. Ag glacadh leis go bhfuil an éifeachtúlacht tras-athscríobh mar an gcéanna i measc samplaí éagsúla, ba cheart go mbeadh an méid cDNA a fhaightear mar an gcéanna, agus is féidir leis an anailís chainníochtúil comparáid a dhéanamh idir leibhéil léirithe géinte éagsúla sa mhéid céanna den RNA iomlán. Agus PCR cainníochtúil fluaraiseachta coibhneasta á dhéanamh, b’fhéidir nach mbeidh gá le cDNA cainníochtúil tar éis tras-athscríobh toisc gur féidir an géine tagartha inmheánach a fheidhmiú mar thagairt.

Baineann sé go príomha leis na géinte, agus níl sé indéanta don chuid is mó de na géinte tras-athscríobh blúire fada. Ar dtús, tá éifeachtúlacht tras-athscríobh droim ar ais i bhfad níos ísle ná éifeachtúlacht PCR. Ar an dara dul síos, cuireann réigiún saibhir GC agus struchtúr tánaisteach go leor géinte srian ar thrascríobh droim ar ais agus PCR. Mar fhocal scoir, is deacair a ráthú ag an am céanna éifeachtúlacht dílseachta agus aimplithe PCR. Sa phróiseas tras-athscríobh, ní féidir le duine a ráthú go bhfaighidh sé blúire fada do ghéinte cóip íseal, go háirithe ag baint úsáide as oligo dT. Maidir le 5 'UTR le níos mó GC, tá sé níos deacra fós. Dá bhrí sin, is modh réasúnach é fós athscríbhinn a aisiompú le primers randamacha, na suíomhanna scoilteachta nádúrtha a aimsiú sa sprioc-blúire, aimpliú de réir deighleoga, agus ansin an díleá srianta agus an ligation a dhéanamh. Go ginearálta, tá sé deacair blúirí níos mó ná 2 kb a aimpliú go díreach, ach ní bhíonn sé dodhéanta i gcónaí iad a fháil: 1.First of all, ráthaíocht sláine RNA / mRNA, agus is fearr eastóscadh TRIZOL. Is féidir trealamh 2.M-MLV RT-PCR a úsáid go díreach. Am annealaithe a leathnú agus líon na dtimthriallta sa phróiseas aimplithe a mhéadú i gceart. De rogha air sin, is féidir PCR neadaithe a chur i bhfeidhm, nó imoibriú amháin nó dhó a dhéanamh ar dtús le dínádúrú agus am síneadh sínte go cuí roimh ghnáth-aimpliú PCR, rud a d’fhéadfadh cabhrú le blúirí a leathnú. Tabhair aird ar dhílseacht an pholaimeras. Is féidir 3.Long Taq a úsáid i PCR chun torthaí idéalach a fháil. 4.For iarratas ar léiriú próitéin, ba cheart polaiméaráise ard-dílseachta a chur i bhfeidhm.

Tá dhá chineál tras-athscríobh droim ar ais á dtairiscint ag TIANGEN: Quant / King RTase agus TIANScript M-MLV. Is é an príomhdhifríocht eatarthu ná méid ionchuir na dteimpléad. Is transcriptase droim ar ais uathúil é Quant, atá difriúil ón M-MLV a úsáidtear go coitianta a dhíorthaítear ó víreas leoicéime Moloney murine. Is éard atá i Quant ná transcriptase droim ar ais ardéifeachtúlachta nua arna chur in iúl go comhuaineach ag innealtóireacht Escherichia coli. Tá cainníocht oiriúnach chun 50 ng-2 μg de RNA a mhéadú le gníomhaíocht trascríobh ard droim ar ais agus toradh ard. I gcomparáid le gnáth-MMLV nó AMV, is é an tréith is mó atá ag Quant ná go bhfuil cleamhnas an-láidir aige le teimpléid RNA agus gur féidir leis teimpléid chasta athscríbhinne a aisiompú gan dínádúrú teocht ard. Maidir le teimpléid a bhfuil ábhar GC níos airde acu, is airde an éifeachtúlacht droim ar ais. Mar sin féin, tá gníomhaíocht RNase H ag an droim ar ais transcriptase seo, a d’fhéadfadh dul i bhfeidhm ar fhad an táirge cDNA (oiriúnach do theimpléid <4.5 kb). Maidir le tras-trascríbhinn traidisiúnta, moltar TIANScript MMLV droim ar ais transcriptase. Is einsím modhnaithe é an RTase seo le gníomhaíocht RNase H an-lag, atá oiriúnach do shintéis cDNA fada (> 5 kb).

Cuirtear trascríobh droim ar ais aon chéim agus aimpliú PCR i gcrích san fheadán céanna gan an clúdach feadán a oscailt idir sintéis cDNA agus aimpliú, rud atá ina chuidiú chun éilliú a laghdú. Ós rud é go n-úsáidtear na samplaí cDNA go léir a fhaightear le haghaidh aimplithe, tá an íogaireacht níos airde, agus ar a laghad 0.01 cg den RNA iomlán. Le haghaidh RTPCR aon-chéime rathúil, úsáidtear primers géine-shonracha de ghnáth chun sintéis cDNA a thionscnamh. Déantar an modh dhá chéim, eadhon trascríobh droim ar ais agus aimpliú PCR in dhá chéim. Ar dtús déantar trascríobh droim ar ais ó theimpléad RNA chun cDNA a fháil, agus tá an cDNA a fhaightear faoi réir imoibriú PCR difriúil amháin nó níos mó. Is féidir leis an modh dhá chéim oligo (dT) nó primers randamacha a úsáid chun sintéis an chéad snáithe de cDNA a threorú, agus féadann sé gach faisnéis mRNA a aisiompú ó shampla ar leith.