Measc 2 × Pfu PCR

Teimpléad A-1

■ Tá neamhíonachtaí próitéine nó coscairí Taq, srl. Sa teimpléad. ——Athraigh teimpléad DNA, bain neamhíonachtaí próitéine nó bain teimpléad DNA le trealamh íonúcháin.

■ Níl dínádúrú an teimpléid iomlán —— Teocht dínádúraithe a mhéadú go cuí agus an t-am dínádúraithe a fhadú.

■ Díghrádú an teimpléid —— Déan an teimpléad a ullmhú.

Primer A-2

■ Drochchaighdeán primers —— Déan an primer a shintéisiú.

■ Díghrádú primer ——Cuir na préimheanna ardchruinnithe i méid beag lena gcaomhnú. Seachain reo agus leá iolrach nó cryopreserved fadtéarmach 4 ° C.

■ Dearadh neamhréireach primers (m.sh. ní leor an fad primer, dimer déanta idir primers, srl.) - Athdhearadh primers (seachain foirmiú dimer primer agus struchtúr tánaisteach)

A-3 Mg²⁺tiúchan

■ Mg²⁺ tá an tiúchan ró-íseal —— Méadú go cuí ar Mg²⁺ tiúchan: An Mg a bharrfheabhsú²⁺ tiúchan trí shraith imoibriúcháin ó 1 mM go 3 mM le eatramh de 0.5 mM chun an Mg is fearr a fháil amach²⁺ tiúchan do gach teimpléad agus primer.

A-4 Teocht análaithe

■ Bíonn tionchar ag an teocht ard annealaithe ar cheangal primer agus teimpléad. —— Déan an teocht annealaithe a laghdú agus an riocht a bharrfheabhsú le grádán 2 ° C.

A-5 Am síneadh

■ Am síneadh gairid —— Méadaigh an t-am síneadh.

Feiniméan: Taispeánann samplaí diúltacha na bandaí seicheamh sprice freisin.

Éilliú A-1 ar PCR

■ Tras-éilliú na spriocsprioc nó na dtáirgí aimplithe —— Go hiondúil gan an sampla ina bhfuil sprioc-ord sa sampla diúltach a phíblíneáil nó iad a dhoirteadh amach as an bhfeadán lártheifneoir. Ba cheart na himoibrithe nó an trealamh a autoclaved chun fáil réidh le haigéid núicléacha atá ann, agus ba cheart éilliú a chinneadh trí thurgnaimh rialaithe diúltacha.

Éilliú imoibrí ——Cuir na himoibrithe i bhfeidhm agus stóráil ag teocht íseal.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ tá an tiúchan ró-íseal —— Méadú go cuí ar Mg²⁺ tiúchan: An Mg a bharrfheabhsú²⁺ tiúchan trí shraith imoibriúcháin ó 1 mM go 3 mM le eatramh de 0.5 mM chun an Mg is fearr a fháil amach²⁺ tiúchan do gach teimpléad agus primer.

■ Dearadh primer míchuí, agus tá homology ag an sprioc-ord leis an seicheamh neamhsprioc. —— Dearadh primers.

Feiniméan: Tá na bandaí aimplithe PCR ar neamhréir leis an méid a bhfuil súil leis, bíodh sé mór nó beag, nó uaireanta bíonn bandaí aimplithe ar leith agus bandaí aimplithe neamhshonracha ann.

Primer A-1

■ Sainiúlacht primer lag

—— Dearadh primer.

■ Tá an tiúchan primer ró-ard —— Méadaigh go cuí an teocht dínádúraithe agus cuir leis an am dínádúraithe.

A-2 Mg²⁺ tiúchan

■ An Mg²⁺ tá an tiúchan ró-ard —— Laghdaigh an tiúchan Mg2 + go cuí: An Mg a bharrfheabhsú²⁺ tiúchan trí shraith imoibriúcháin ó 1 mM go 3 mM le eatramh de 0.5 mM chun an Mg is fearr a fháil amach²⁺ tiúchan do gach teimpléad agus primer.

A-3 Polaiméaráise in-theirmeach

■ Méid iomarcach einsím —— Laghdaigh méid einsím go cuí ag eatraimh 0.5 U.

A-4 Teocht análaithe

■ Tá an teocht annealaithe ró-íseal —— Méadaigh go cuí an teocht annealaithe nó glac leis an modh annealaithe dhá chéim

Timthriallta PCR A-5

■ An iomarca timthriallta PCR —— Laghdaigh líon na dtimthriallta PCR.

Primer A-1—— Sainiúlacht faoi leith —— Déan an primer a dhearadh, suíomh agus fad an phríomhaire a athrú chun a shainiúlacht a fheabhsú; nó PCR neadaithe a dhéanamh.

Teimpléad A-2 DNA

—— Níl an teimpléad íon ——Athraigh an teimpléad nó bain DNA le trealamh íonúcháin.

A-3 Mg²⁺ tiúchan

——Mg²⁺ tá an tiúchan ró-ard —— Laghdaigh Mg go cuí²⁺ tiúchan: An Mg a bharrfheabhsú²⁺ tiúchan trí shraith imoibriúcháin ó 1 mM go 3 mM le eatramh de 0.5 mM chun an Mg is fearr a fháil amach²⁺ tiúchan do gach teimpléad agus primer.

A-4 dNTP

—— Tá tiúchan na dNTPanna ró-ard —— Laghdaigh tiúchan an DNTP go cuí

A-5 Teocht análaithe

——Teocht teocht íseal annealaithe —— Méadaigh go cuí an teocht annealaithe

Timthriallta A-6

——Cuir go leor timthriallta —— Laghdaigh uimhir na rothaíochta

Is é an chéad chéim an polaiméaráise cuí a roghnú. Ní féidir polaiméaráise Taq rialta a léamh profaí mar gheall ar easpa gníomhaíochta eis-scaoilte 3'-5 ', agus laghdóidh an neamhréiteach éifeachtúlacht síneadh na blúirí go mór. Dá bhrí sin, ní féidir le polaiméaráise rialta Taq sprioc-blúirí níos mó ná 5 kb a mhéadú. Ba cheart polaiméaráise Taq le modhnú speisialta nó polaiméaráise ard-dílseachta eile a roghnú chun éifeachtúlacht síneadh a fheabhsú agus freastal ar riachtanais aimpliú blúire fada. Ina theannta sin, éilíonn aimpliú blúirí fada coigeartú comhfhreagrach ar dhearadh primer, am dínádúraithe, am síneadh, pH maolánach, srl. De ghnáth, is féidir toradh níos fearr a bheith mar thoradh ar primers le 18-24 bp. D’fhonn damáiste teimpléid a chosc, ba cheart an t-am dínádúraithe ag 94 ° C a laghdú go 30 soicind nó níos lú in aghaidh an timthrialla, agus ba cheart go mbeadh an t-am chun teocht a ardú go 94 ° C roimh an aimpliú a bheith níos lú ná 1 nóiméad. Thairis sin, má shocraítear teocht an fhadaithe ag thart ar 68 ° C agus an t-am síneadh a dhearadh de réir an ráta 1 kb / nóim, féadfar aimpliú éifeachtach a dhéanamh ar blúirí fada.

Is féidir an ráta earráide aimpliú PCR a laghdú trí pholaiméir DNA éagsúla a úsáid a bhfuil an-dílseacht iontu. I measc na bpolaiméar DNA Taq go léir a fuarthas go dtí seo, tá an ráta earráide is ísle agus an dílseacht is airde ag einsím Pfu (féach an tábla faoi iamh). Chomh maith le roghnú einsímí, is féidir le taighdeoirí ráta sócháin PCR a laghdú tuilleadh trí dhálaí imoibrithe a bharrfheabhsú, lena n-áirítear comhdhéanamh maolán a bharrfheabhsú, tiúchan polaiméaráise in-theirmeach agus uimhir timthriall PCR a bharrfheabhsú.